4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации
клеток Aspergillus terreus 44-62 - продуцента ловастатина
в атмосферном воздухе населенных мест
Методические указания
МУК 4.2.1768-03.

Методические указания. - М.: Федеральный центр Гос­санэпиднадзора Минздрава России, 2004. .

1.  Разработаны Российским государственным медицинским университе­том (к. б. н. Н. И. Шейной).

2.  Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Россий­ской Федерации - Главный государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г.

3.  Введены в действие с I декабря 2003 г.

.Введены впервые.

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Aspergillus terreus 44-62 - продуцента ловастатина в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2. Биологическая характеристика Aspergillus terreus 44-62 и его гигиенический норматив

Штамм Aspergillus terreus 44-62 является продуцентом ловастатина. Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Рост на питательной среде и ферментация могут происходить при температуре 20-37 °С. Оптимальная температура роста 27- 30 °С, оптимальное значение рН среды - 5,0-6,0, культивирование 12 суток.

Строгий аэроб. Утилизирует глюкозу, фруктозу, мальтозу и глицерин. Хорошо растет на многих органических субстратах: овсяная, рисовая и кукурузная мука. В качестве источников азота благоприятно использование пептона, дрожжевого экстракта, гидролизата казеина. Среди неорганических солей предпочтительно использование хлорида натрия, сульфата магния и фосфата калия. Для размножения можно использовать сусло-агар 5-6 °Б.

Систематическое положение микроорганизма

Уже на 4-5 дни развития гриб появляется в виде характерной кремоватой округлой маленькой колонии с оранжевым пятном в центре. Поверхность колонии бахатисто-шероховатая. Однако своего терминального развития микромицет достигает к 11-12 дню, когда наиболее ярко выражены его культурально-морфологические свойства.

12-суточная культура на агаризованной питательной среде представляет собой округлые неправильной формы колонии с характерной нерегулярно изрезанной поверхностью, напоминающей вулканический профиль. В центре колонии, как правило, имеется кратер. Максимальный диаметр колоний 3,5-4,0 см.

Окраска колоний от оранжево-коричневого у основания до желто-коричневого на вершине. Мицелий плотный, компактный без воздушного пушистого слоя. Гифы короткие, сильно разветвленные, состоящие из расширенных клеток нерегулярной формы. Боковые ветви короткие, пор немного. Типичных конидиеносцев нет. Субстратный мицелий прорастает глубоко в питательную среду, образуя воздушные полости на дне чашки.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 30 кл/м³, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток плесневого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность среды сусло-агар и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на А - 5 сутки развития при повышенной температуре.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818(щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77 Термостаты электрические суховоздушные или водяные   Автоклав электрический ГОСТ 9586-75 Бокс, оборудованный бактерицидными лампами   Холодильник бытовой   Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200   Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211   Лупа с увеличением ×10 ГОСТ 25706-83 Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100мм   Пробирки биологические, вместимостью20 и 35 мл Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл ГОСТ 10515-75 ГОСТ 10515-75 ГОСТ 1770-74 Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74 Секундомер ГОСТ 9586-75 Барометр ГОСТ 24696-79 Марля медицинская ГОСТ 9412-77 Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556- 81

5.2. Реактивы, растворы Среда сусло-агар: солодовое сусло(значение Баллинга от 5 до 6°) - 98 %, агар-агар - 2 %, рН среды 5,0 - 6,0, режим стерилизации: Р - 0,8 кгс/см2, 40 мин   Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67 Молочная кислота(синоним-альфа-оксипропионовая кислота, для подавления посторонней бактериальной флоры) ГОСТ 490-79

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С), атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 15 л/мин на поверхность среды сусло-агар. Время аспирации воздуха (5- 30 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших на 3 сутки после посева проб воздуха, по культурально-морфологическим признакам и яркой оранжево-желтой пигментации среды. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 100 колоний продуцента.

Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50-60 °С, добавляют молочную кислоту из расчета 2 мл на 0,5 л среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 38-42 °С (повышенная температура, способствующая более быстрому росту колоний и плодоношений рода As-pergillus). Через 3-5 суток производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м' воздуха производят по формуле:

кл/м³ ,где

Х- концентрация клеток продуцента в воздухе,

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке,

1 000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха,

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол №
количественного микробиологического анализа штамма-продуцента
Aspergttlus terreus 44-62 в атмосферном воздухе
населенных мест

1. Дата проведения анализа______________

2. Место отбора пробы__________________

3.Название лаборатории_________________

4.Юридический адрес организации_______

Результаты микробиологического анализа

Шифр или № пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация, кл/м3

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-96. М. 1991.693с.

2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ «Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности микробиологической промышленности. М.,1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.

5. ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ».

6. Влодавец В. В. К определению плесневых грибов рода Asper-gillus в воздухе лечебных учреждений// Гиг. и сан., 1988. № 8. С. 93- 95.

7. Бабьева И. П., Зенова Г. М. Биология почв. М.: МГУ. 122с.

содержание